Med begreppet ehec avses Escherichia coli (E. coli) som har förmåga att producera shigatoxin och framkalla blodig diarré hos människa. Sjukdomsbilden vid infektion med ehec kan dock variera från mild diarré till livshotande sjukdom. I typfallet insjuknar den smittade med buksmärtor och vattning diarré som inom 1-2 dygn utvecklas till hemorragisk kolit med blodiga diarréer. Normalt läker infektionen ut inom 7-14 dagar (1-3), men i minst 3-5 % av fallen utvecklas hemorragiskt uremiskt syndrom (HUS) (4). Prognosen vid HUS varierar, mortaliteten är ett par procent, och upp mot 40 % utvecklar en bestående njurfunktionsnedsättning (1). Risken att utveckla HUS är störst hos små barn (1, 3). Hur länge ehec utsöndras i feces efter symptomfrihet är inte fullständigt känt, men mediandurationen förefaller vara ett par veckor (5-7). Asymtomatiskt bärarskap av ehec förekommer, men prevalensen är okänd.

Förmågan att producera shigatoxin är helt avgörande för patogeniciteten hos ehec (8). Shigatoxin delas in i två typer, shigatoxin 1 (Stx1) och shigatoxin 2 (Stx2) som kodas av generna stx1 respektive stx2 (5). Stx1 och stx2 delas vidare in i olika subtyper, stx1a, c och d samt stx2a-i (9). Generna för shigatoxin är inkorporerade i profager i bakteriens kromosomala genom. En och samma E. coli kan ha mer än en profag och därmed olika kombinationer av stx-gener (8). Förekomst av stx2 är associerad med svårare sjukdomsbild än stx1 och framför allt stx-subtypen stx2a (med eller utan stx2c) är starkt associerad med utveckling av HUS (10). En annan viktig virulensfaktor hos ehec är intimin som kodas av eae-genen och medierar vidhäftning till tarmepitelet. Kombinationen av stx2 och eae är mycket starkt kopplad till blodig diarré och HUS-utveckling och ehec som varken har stx2 eller eae är endast sporadiskt associerade med HUS, med få undantag. (10).

Liksom övriga E. coli kan ehec delas in i olika serotyper utifrån vilka ytstrukturer bakterien har. Över 100 olika serotyper av ehec har associerats med infektion hos människa (11). I Sverige rapporteras drygt 500 ehec-fall per år hos människa, varav 50-60 % är inhemskt smittade. Majoriteten av fallen är sporadiska och en tydlig säsongsvariation finns med störst andel fall under sommar och höst. Högst incidens ses i åldersgruppen 1-4 år (12). Sedan 2009 orsakas majoriteten av ehec-fallen i Sverige av andra serogrupper än O157 som dominerade före 2009 (12), en dominans som bland annat kan bero av odlingspåvisningsmetodiken tidigare varit anpassad just för denna typ.

Ehec är en anmälningspliktig och smittspårningspliktig sjukdom (13). Påvisning av shigatoxin-gener i ett kliniskt prov uppfyller den rekommenderade falldefinitionen vid anmälan enligt i Smittskyddslagen, oavsett isolering av ehec-bakterien eller inte (14).

Odling

Anrikning

Molekylärbiologiska metoder

Nio kliniska mikrobiologiska laboratorier i Sverige som utför ehec-diagnostik från detektion till isolering tillfrågades om deltagande i en enkätundersökning avseende hur aktuell ehec-diagnostik bedrivs (Hallands sjukhus Halmstad, Sahlgrenska Universitetssjukhuset, Region Skåne, Centrallasarettet Växjö, Centralsjukhuset i Karlstad, Universitetssjukhuset i Linköping, Karolinska Universitetslaboratoriet, Akademiska sjukhuset Uppsala och Norrlands Universitetssjukhus Umeå). Förfrågan om deltagande skedde per mejl och för de laboratorier som accepterade deltagande inhämtades informationen rörande laboratoriets aktuella ehec-diagnostik via en 15-30 minuter lång telefonintervju baserad på tidigare utskickade frågor. Frågorna framgår av Bilaga 1.

Tre av de sju deltagande laboratorierna använder en multiplex PCR direkt på feces för diagnostik av bakteriella fecespatogener och i dessa PCR-paneler ingår ehec (tillsammans med bl. a salmonella, shigella, yersinia och campylobacter), vilket medför att alla fecesprover rutinmässigt analyseras för ehec. Fyra av sju laboratorier utför ehec-analys endast på vissa prover, samtliga om beställaren begärt analysen. Dessutom används olika selektionskriterier för när ehec-analys läggs till; tre av fyra laboratorier lägger till ehec-analys om det av remissen framkommer anamnes på blodig avföring/blodig diarré, njurpåverkan eller HUS och ett av dessa laboratorier lägger även till ehec-analys om avföringen är makroskopiskt blodig. Ett laboratorium lägger till ehec-analys vid blodig diarré hos barn under 12 års ålder, men inte rutinmässigt vid anamnes på blodig diarré. Säsongsberoende kriterium i form av att ehec analyseras på alla fecesprover från barn under sex års ålder perioden maj t.o.m. september används av ett laboratorium.

Av de fyra laboratorier som inte använder direkt PCR på feces odlar tre ut provet på agarplattor medan det fjärde laboratoriet anrikar provet i Tryptic Soy Broth. PCR utförs därefter från primärstryk och beroende på plattuppsättning eventuella misstänkta kolonier, respektive anrikat material, se tabell 1. Ett av de fyra laboratorier som i grunden endast utför ehec-analys på vissa prover har även en multiplex direkt PCR på feces i form av en kommersiell gastroenteritpanel (FILMARRAY®) inkluderande ehec-analys och som den behandlande läkaren kan beställa. Se flödesschema, figur 1, för ehec-diagnostik initialt förfarande.

Samtliga tre laboratorier som utför multiplex PCR direkt på feces rutinmässigt på alla fecesprover använder sig av inhouse-PCR. De laboratorier vars direkt-PCR inte separerar stx1 och stx2 använder en annan PCR inför isoleringsförfarandet. Inför isoleringsförfarandet använder samtliga laboratorier in house-PCR. Vilka odlingsmedier som används varierar och framgår av Bilaga 2.

Figur 1.

Sex av de sju deltagande laboratorierna uppger att de alltid försöker isolera stammen vid ett nytt ehec-fall. Ett laboratorium har satt en gräns för isoleringsförsök i form av cycle threshold (Ct)-värde < 31 i PCR-analysen. Flera laboratorier nämner att de funderar på att införa en Ct-värdesgräns då man upplever att isoleringsförsöket sällan är framgångsrikt på prover med höga Ct-värden.

Förfarandet vid isolering skiljer sig åt mellan laboratorierna och ingen enhetlighet ses, för detaljer se bilaga 2. Antalet enskilda kolonier som testas varierar från 5 till maximalt 40. De laboratorier som använder direkt-PCR som inte separerar stx1 och stx2 analyserar generellt ett primärstryk eller slamningen från första PCR:en på nytt så att information om förekomst av stx1 respektive stx2 erhålls, även om man inte lyckas isolera stammen. Figur 2 visar antal enskilda kolonier som testas samt den andel av anmälda ehec-fall under 2017 där man lyckats isolera stammen. För beräkning av det sistnämnda har data från SmiNet används i form av antalet anmälda ehec-fall i förhållande till antalet fall där Folkhälsomyndigheten fått ett ehec-isolat inskickat (inom ramen för det mikrobiella övervakningsprogrammet 2017). Hur stor andel av ehec-fallen under 2017 där stammen lyckats isoleras varierar mellan de olika laboratorierna, som lägst 29 % och som högst 86 %.

Figur 2. Isoleringsfrekvens av ehec och antal kolonier testade. Andel EHEC-fall där stammen kunnat isoleras saknas för lab 3 och 6 pga. att dessa tillhör storstadsregioner med flera olika laboratorier varför beräkningarna blir osäkra. De lab som använder direkt PCR på feces rutinmässigt på alla prov är lab 4, 5 och 6.

*Andel går ej att visa.

Samtliga laboratorier har ehec-diagnostiken som ackrediterad metod. Majoriteten av laboratorierna lämnar ett preliminärt svar då den första PCR-analysen blir positiv för ehec, smittskyddsenheten underrättas och SmiNet-anmälan görs. Kompletterande svar lämnas efter isoleringsförsök. Vid uppföljande prov från patient med känd ehec görs generellt ett nytt isoleringsförsök om stammen inte isolerats i tidigare prov. Om stammen däremot isolerats i ett tidigare prov och samma kombination av gener (stx1, stx2 och/eller eae) detekteras i det uppföljande provet svarar majoriteten av laboratorierna att inget nytt isoleringsförsök görs förutsatt att smittskyddsenheten inte begär det.

Incidensen av ehec påverkas bland annat av förekomst av eventuella utbrott och varierar från år till år. Stor skillnad i incidens beror även på om ehec-analys utförs rutinmässigt eller om den endast utförs på vissa prover. När t ex region Örebro införde multiplex PCR-panel på feces i juni 2017 ökade antal fall markant. Tidigare hade ehec-analys enbart utförts på specifik begäran. Antalet anmälda ehec-fall de senaste fem åren hade i regionen legat på mellan 0-5 fall årligen men år 2017 anmäldes 39 fall (21). Utvecklingen går mot att allt fler laboratorier inför direkt-PCR på feces. Fördelen blir att fler fall diagnosticeras, även fall där den behandlande läkaren inte misstänkt ehec och inte då hade specifikt efterfrågat analysen. En tidig diagnos kan förhindra annan onödig utredning, förhindra antibiotikabehandling som eventuellt kan öka risken för HUS, samt minska risken för smittspridning. En nackdel kan vara att PCR-analyserna är så känsliga att även mycket låga mängder ehec detekteras, vars kliniska relevans kan vara svårbedömd hos t ex en symptomfri patient eller om provet tagits på fel indikation. Att fler fall hittas innebär även ett merarbete för laboratorierna och smittskyddsenheterna och det är ännu inte känt hur stor effekt detta har på möjligheten att upptäcka utbrott och förhindra smittspridning eller om det primärt är tämligen asymtomatiska patienter med låg risk att smitta andra som hittas i tillägg vid rutinmässig ehec-analys.

Svårigheter med att tillämpa selektionskriterier för när ehec-analys ska utföras är att viktiga anamnestiska uppgifter såsom blodiga diarréer/njursvikt inte alltid framgår av remissen. Problem med åldersberoende selektionskriterier är att även om högst incidens ses i de lägsta åldersgrupperna förekommer infektion med ehec och HUS i alla åldrar. Säsongsberoende tillägg av ehec-analys under sommar/höst kan användas, men allvarliga infektioner med ehec förekommer året runt. Ett utbrott av ehec O157 där smittkällan utgjordes av kött som slaktats hösten 2016 orsakade flera HUS-fall första kvartalet 2017 på grund av att köttet varit fryst innan konsumtion (22).

Ehec-diagnostiken bör innefatta detektion av både O157:H7 och övriga serotyper, något man måste beakta i sitt val av odlingsmedium. Det är dock svårt att utifrån denna begränsande undersökning dra slutsatser om vilket odlingsmedium/vilken kombination av odlingsmedier som helst bör användas. De PCR-metoder som används behöver kunna skilja på stx1 och stx2då detta ger information huruvida ehec-stammen är en låg- eller högrisk-stam avseende HUS-utveckling, vilket har stor betydelse för smittskyddsenhetens fortsatta hantering av fallet. Det är en fördel att erhålla denna information redan i direkt PCR-analysen.

Isolering krävs för vidare karaktärisering med serotypning och helgenomsekvensering som ger information om stx-subtyp, virulensgener, resistensgener och evolutionära samband vilket är viktigt ut epidemiologisk synpunkt. Alla deltagande laboratorier har olika förfaranden vid isoleringsförsök och isoleringsfrekvensen ligger kring 50 % för flera laboratorier. Två laboratorier avviker dock, det ena isolerar stammen i en lägre andel av fallen (29 %) och det andra lyckas isolera stammen i en mycket hög andel av fallen (86 %). Det är svårt att dra slutsatser om exakt vad i deras diagnostiska flöde som orsakar dessa resultat. Faktorer som kan inverka på att isoleringsfrekvensen är lägre vid det första laboratoriet är att inga selektiva agarplattor för ehec används, vilket potentiellt kan minska träffsäkerheten när kolonier plockas. Laboratoriet får även prover skickat till sig från ett annat laboratorium i regionen och transporten skulle kunna inverka negativt i form av överväxt av normalfloran. Det laboratorium som isolerar ehec-stammen i en mycket hög andel av fallen analyserar betydligt fler kolonier än övriga laboratorier.

En av svårigheterna med ehec-diagnostik är att bedöma hur ehec-stammen bäst isoleras och hur extensivt isoleringsförsök som bör göras. Antalet kolonier som testas påverkar givetvis möjligheten till isolering, men samtidigt har de kliniska laboratoriernas resurser en begränsning. Då multiplexa PCR-paneler direkt på faeces blir allt vanligare med följden att fler ehec-fall diagnosticeras kommer denna fråga att bli än mer aktuell. Ur ett kliniskt perspektiv och smittskyddshänseende är det meningsfullt att dela in ehec-stammar i högrisk- respektive lågrisk-stammar avseende allvarlig sjukdom, då framför allt HUS, utifrån stx-profil. I Sverige hanteras individer i riskyrke/på förskola olika beroende på förekomst av stx1 eller stx2 och eventuell HUS-koppling (19, 20). I Danmark och Norge utför Statens Serum Institut respektive Folkehelseinstituttet löpande en riskvärdering av specifika ehec-stammars association med HUS och beroende på stx-subtyp delas stammarna in i HUS-associerade respektive övriga/lågvirulenta och smittskyddsåtgärder regleras därefter (23-25). Generellt sett görs idag i Sverige ingen skillnad mellan stx1- och stx2-positiva prover avseende hur extensivt isoleringsförsök som görs, förutom vid HUS-fall då originalprovet kan skickas till Folkhälsomyndigheten vid isoleringssvårigheter på det kliniska laboratoriet. I analogi med att det är meningsfullt att vidta olika smittskyddsåtgärder beroende på stx-typ skulle det kunna vara meningsfullt att anpassa isoleringsförsökets omfattning utifrån stx-typ. Vid allvarlig klinisk bild såsom HUS bör isolering av stammen alltid eftersträvas oavsett stx-typ. Ct-värde, oavsett stx-typ, skulle också kunna utgöra en fingervisning om när isoleringsförsök kan lyckas.

Färre än hälften av de kliniska mikrobiologiska laboratorierna i Sverige utför isolering av ehec, något som kunde visas vid enkätundersökningen 2015. Utvecklingen går mot att allt fler inför ehec som en del av den rutinmässiga feces diagnostiken med multiplex-PCR, men liknande utveckling har inte skett avseende isolering. Det kan därmed ses som troligt att än fler PCR positiva ehec-prov kommer att skickas mellan laboratorier inom landet för försök till isolering vilket kan ha en negativ effekt på möjligheten att isolera. En annan utmaning är att det inte finns en tydlighet i logistiken kring ett ehec-prov där tre laboratorier kan bli involverade från det första PCR-positiva svaret fram till den epidemiologiska typningen vid Folkhälsomyndigheten. Framför allt i utbrottsituationer där snabba svar krävs för att få en förståelse för om fall tillhör ett utbrott eller ej så kan denna procedur med att skicka ehec-prov mellan olika laboratorier vara utmanande i förståelsen för hos vem och hur långt analysen har kommit, varför det finns ett behov att framöver att göra en översyn även över detta förfarande.